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Molecular Design and Characterization of the Anticomplementary and ACE-inhibitory Peptides Expressed in Escherichia coli

Molecular Design and Characterization of the Anticomplementary and ACE-inhibitory Peptides Expressed in Escherichia coli

자료유형
학위논문
개인저자
오광석
서명 / 저자사항
Molecular Design and Characterization of the Anticomplementary and ACE-inhibitory Peptides Expressed in Escherichia coli / Oh, Kwang Seok.
발행사항
서울 :   고려대학교 대학원 ,   2003.  
형태사항
ⅷ, 108 p. : 삽도 ; 26 cm.
학위논문주기
학위논문(박사) -- 고려대학교 대학원 생명공학과 분자생물학전공 2002
학과코드
0510   6YD48   66  
서지주기
참고문헌 : p. 94-97
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전자정보

No. 원문명 서비스
1
Molecular Design and Characterization of the Anticomplementary and ACE-inhibitory Peptides Expressed in Escherichia coli
PDF 초록 목차
No. 소장처 청구기호 등록번호 도서상태 반납예정일 예약 서비스
No. 1 소장처 과학도서관/학위논문서고/ 청구기호 0510 6YD48 66 등록번호 123022937 도서상태 대출가능 반납예정일 예약 서비스 B M
No. 2 소장처 세종학술정보원/학위논문실/ 청구기호 0510 6YD48 66 등록번호 153038443 도서상태 대출가능 반납예정일 예약 서비스
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No. 1 소장처 과학도서관/학위논문서고/ 청구기호 0510 6YD48 66 등록번호 123022937 도서상태 대출가능 반납예정일 예약 서비스 B M
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No. 1 소장처 세종학술정보원/학위논문실/ 청구기호 0510 6YD48 66 등록번호 153038443 도서상태 대출가능 반납예정일 예약 서비스

컨텐츠정보

초록

식물체나 다른 개체에서 발견되는 많은 보체저해제는 예전부터 항염증 제제로 인식되어왔다. 보체저해제 중 분자량이 작은 저해제는 가격적인 면이나 조직을 통과하는 면에서 염증 치료제로서의 많은 장점을 가지고 있다. 이런 관점에서 보면, 최근에 Schistosoma 기생체의 표면에서 발견된 Sh-CRIT-ed1는 상대적으로 작은 분자량을 가진 보체저해제로서 앞으로 개발할 매력이 있는 물질이다. 이 펩타이드는 C3 convertase 형성을 간섭함으로써, 보체 활성화 경로 중 classic 경로를 저해할 수 있다.
그러나 Sh-CRIT-ed1의 대량생산 관점으로 볼 때, Schistosoma 기생체에서 분리 정제보다는, DNA 재조합기술을 이용한 방법이 좀더 효과적일 것이다. 따라서 본 실험에서는, 좀더 효율적인 정제와 수율을 위한 방법을 모색하고자 한다. 먼저, C-말단부위에 헥사히스티딘 코돈을 첨가한 Sh-CRIT-ed1 유전자를 합성하고 이를 BL21 대장균을 이용하여 정제를 실시하였다. 또한, 좀더 효과적인 대량생산을 위하여 Sh-CRIT-ed1 유전자의 반복체를 구성하였고, 연속적인 흡착 크로마토그래피와 적절한 thrombin, CNBr 절단을 통하여 1 리터 배양 시 약 9.03mg의 수율을 얻을 수 있었다. 이러한 방법으로 얻어진 재조합 Sh-CRIT-ed1 (rSh1)은 면역용혈반응 시에 IC_(50) = 6.02 μM의 강한 항보체 활성을 보였다.
또한, rSh1 과 C2의 결합 시에 관여하는 아미노산 잔기를 분석함으로써, 본연의 rSh1보다 더 우수한 성질을 가진 저해제를 찾으려 하였다. 본 연구에서는 rSh1는 물론, 인간과 쥐의 C4 β-chain과 Sh-CRIT-ed1간의 아미노산서열을 비교하여 가장 보존성이 높은 아미노산 잔기를 치환한 9개의 rSh1 유사체를 구축하고 이를 통하여 항보체 활성과 in vitro에서의 C2 결합능력을 측정 비교 하였다. 결과로서, C2사이의 결합 시에 Sh-CRIT-ed1의 ^10K, ^17E, ^19K, ^26Y 잔기가 접촉면에서 접점으로 작용한다는 사실을 제안 하게 되었다. 그래서, Sh-CRIT-ed1의 C 말단부위 (^17H-^26Y)의 반복을 통하여 위의 제시된 4개의 잔기 위치를 만족할 뿐만 아니라 인간의 C4 β-chain과 좀더 유사한 구조를 갖는 반복체, 즉, rH17d를 구축함으로써 좀더 높은 항보체능력를 가진 저해제를 만들 수 있었다. rSh1과 rH17d 두 저해제 모두 투여 양과 비례하는 저해활성 능력을 보였으며, 각기 ~6.02μM 과 ~1.2 μM의 IC50값을 보였다. 더 나아가서 비록 이 두 물질은 펩타이드의 성질을 가지고 있지만, in vivo에서도 높은 저해활성 능력을 유지하였다. 독립된 이 세가지 실험, 면역용혈반응과 GST-pull down assay 그리고 in vivo assay인 Forssman systemic shock을 통하여 얻어진 결과는 rSh1과 rH17d 모두 보체활성 저해제로 적용할 수 있는 효능 있는 물질임을 제안하고 있다. 또한, 이 두 물질은 in vivo에서도 높은 활성을 유지할 뿐만 아니라 오직 보체의 classic 경로만을 저해하는 능력을 보임으로서, 체내에서 감염 시 필요한 보체의 부분적으로 좋은 부분, 예를 들면, alternative 경로, lectin 경로는 허락할 수 있는 장점이 있다. 그러므로 상기 재조합 rSh1, rH17d 두 물질은 산업적으로 항염증 치료제를 대량 생산하는데 매우 유용한 후보 군이라 사료된다.
한편, angiotensin I-converting enzyme (ACE)은 비활성인 angiotensin I 에서 혈관수축제인 angiotensin II로의 전환을 유발시키는 혈압조절에 중요한 효소 중의 하나로, 이 효소의 저해는 고혈압을 막는 중요한 요소로 인식되어 왔다. 최근 식품에서 유래된 ACE 저해제로서 강압효과가 있는 펩다이드가 다수 분리되어 있으며, 식품이 주는 안정성과 매일 일상의 식사에서 제공되고 있다는 편이성에서 고혈압 치료 또는 예방을 위한 기능성 식품 소재로

The Sh-CRIT-ed1 is a complement inhibitory peptide of presenting on the Schistosoma parasite surface, which is able to inhibit the classic pathway of complement activation by interfering with the formation of C3 convertase, C4b2a. In the present study, chemically synthesized oligonucleotides encoding Sh-CRIT-ed1 with an additional hexahistidine codon at the C-terminus were expressed and purified in E. coli BL21. The cloned gene, which was multimerized 4 times in pBlue-script II KS (+) at the isoschizomer sites (BamHI, BglII), was named Sh4, and expressed in E. coli BL21 harboring pGEX-KG. The fusion protein (GST-Sh4) was purified with a high yield successively by affinity chromatographies of Glutathione Sepharose 4B and Ni-NTA-agarose. Recombinant Sh-CRIT-ed1 was obtained readily by thrombin digestion and CNBr cleavage of GST-Sh4, and the yield was 9.03 mg from 1-liter culture of E. coli BL21 harboring pGEX-Sh4. Furthermore, the contribution degree of individual amino acid residues in rSh1-C2 binding was examined, and it was the basis to search and design peptides with higher anticomplementary activity than the recombinant Sh-CRIT-ed1 (rSh1). The rSh1 and nine recombinant Sh-CRIT-ed1 analogs were constructed and used to evaluate the anti-complementary activities and the C2 binding activities. The K, results suggested that ^10K, ^17E, ^19K, ^26Y residues of Sh-CRIT-ed1 functioned as interface residues in the interaction between C2 and Sh-CRIT-ed1 and that dimerizing the C-terminal motif (^17H-^26Y) of Sh-CRIT-ed1 with satisfying four residues' positions could generated an recombinant Sh-CRIT-H17 dimer (rH17d) peptide with high anti-complementary activity. The rSh1 and rH17d inhibited complement in a dose-dependent manner, giving an IC_50 of~6.02 μM and~1.2 μM. The congruency of results obtained using three independent approaches, namely, in vitro hemolytic assay, GST-pull down assay and in vivo Forssman systemic shock strongly suggest that the rSh1 and rH17d may

목차

TABLE OF CONTENTS = ⅰ
LIST OF TABLES = ⅲ
LIST OF FIGURES = ⅳ
ABBREVIATIONS AND TERMINOLOGY = ⅵ
Abstract = ⅷ
INTRODUCTION = 1
CHAPTER 1 Expression and Purification of the Anticomplementary Peptide Sh-CRIT-ed1 (formerly Sh-TOR-ed1) as a tetramultimer in Escherichia coli = 11
Abstract = 12
Introduction = 13
Materials and Methods = 15
Results and Discussion = 21
References = 36
CHAPTER 2 Inhibitory effects of recombinant Sh-CRIT-ed1 analogs on the complement activation = 40
Abstract = 41
Introduction = 43
Materials and Methods = 45
Results = 51
Discussion = 62
References = 68
CHAPTER 3 Expression and Purification of ACE-inhibitory peptide Multimer from Synthetic DNA in Escherichia coli = 73
Abstract = 74
Introduction = 75
Materials and Methods = 77
Results and Discussion = 82
References = 94
CONCLUSION = 98
ABSTRACT IN KOREAN = 104