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Characterization of the Protein Kinase R in the Interferon-mediated Inhibition of Hantaan Virus Replication

Characterization of the Protein Kinase R in the Interferon-mediated Inhibition of Hantaan Virus Replication

자료유형
학위논문
개인저자
박세훈
서명 / 저자사항
Characterization of the Protein Kinase R in the Interferon-mediated Inhibition of Hantaan Virus Replication / Se-Hoon Park.
발행사항
서울 :   고려대학교 대학원 ,   2003.  
형태사항
ⅵ, 76 p. : 삽도 ; 26 cm.
학위논문주기
학위논문(박사) -- 고려대학교 대학원 생명공학과 분자생물학전공 2002
학과코드
0510   6YD48   63  
서지주기
참고문헌 : p. 63-73
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전자정보

No. 원문명 서비스
1
Characterization of the Protein Kinase R in the Interferon-mediated Inhibition of Hantaan Virus Replication
PDF 초록 목차
No. 소장처 청구기호 등록번호 도서상태 반납예정일 예약 서비스
No. 1 소장처 과학도서관/학위논문서고/ 청구기호 0510 6YD48 63 등록번호 123022927 도서상태 대출가능 반납예정일 예약 서비스 B M
No. 2 소장처 세종학술정보원/학위논문실/ 청구기호 0510 6YD48 63 등록번호 153038440 도서상태 대출가능 반납예정일 예약 서비스
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컨텐츠정보

초록

한타바이러스는 3개의 분절된 RNA 유전체를 소유하는 바이러스로서 인간에 감염하여 유행성 출혈열 또는 바이러스에 의한 폐질환을 유발한다. 본 연구는 이러한 병원성 바이러스에 대한 인터페론에 의한 항바이러스 효과를 연구하였다. 특히, 인터페론에 의해 발현이 유도되며 항바이러스 효과에 주요한 역할을 담당하는 인산화 효소인 PKR에 연구의 초점을 맞추었다. 한타바이러스의 대표적인 숙주세포인 VeroE6 세포에 인터페론 알파를 전처리함으로서 한타바이러스의 원형바이러스인 한탄바이러스 감염에 대한 항바이러스 효과를 유발하였다. 즉 바이러스 감염 후 1~3일 사이에 바이러스의 복제가 10~100배정도 감소하였다. 하지만 인터페론에 의한 항바이러스의 효과는 일시적이며 감염후기에는 사라지는 현상을 관찰하였다.
인터페론에 의한 항바이러스 기작을 연구하고자 VeroE6 세포로부터 원숭이 PKR 유전자를 역전사-연쇄중합효소반응으로 클로닝하였다. PKR cDNA는 135bp의 5’-UTR, 1,650bp의 단백질 암호화 부위, 878bp의 3’-UTR로 구성되어있다. 또한 아미노산 조성에 있어서 인간 및 쥐 PKR 단백질과는 각각 83%, 60% 정도의 일치성을 가지는 것을 확인하였다. 또한 PKR 유전자 클로닝 과정에서 야생주 PKR 유전자 외에도 크기가 작은 돌연변이체 PKR 유전자를 클로닝하였다. 염기서열 분석결과 돌연변이체 PKR 유전자는 12번째 exon이 in-frame으로 결손된 것을 확인하였으며 이는 유전체의 변화에 의한 것이 아니라 alternative splicing에 의한 발현임을 확인하였다. 역전사-연쇄중합효소반응 및 면역항체법에 의한 분석결과 돌연변이체 PKR(PKR-△12)은 VeroE6 세포에서만 특징적으로 발현되는 것을 확인할 수 있었다. 즉, 인간에서 유래된 HaLa, Jurkat 세포 및 원숭이에서 유래 된 CV-1 세포에서도 PKR-△12의 발현을 확인 할 수 없었다.
VeroE6 세포는 인터페론 처리나 한탄바이러스의 감염에 의해 PKR 단백질이 절단되는 현상이 관찰되었다. 절단 위치는 PKR 단백질의 247번째와 248번째 아미노산 사이에서 이루어지며 절단에 의해서 PKR 단백질의 인산화 효소 부위 (Kinase domain)가 출현하게 된다. PKR-△12는 야생주 PKR과 마찬가지로 세포내에서 주로 세포질에 위치함을 면역조직화학분석법으로 확인하였다. 하지만 세포내에서 PKR-△12의 과발현을 유도하였을 경우 일부의 세포에서 세포독성이 확인되었다. 이러한 PKR 단백질의 인산화 효소 기능을 알아보기위해서 in vitro transcription/translation한 PKR 단백질을 이용하여 자체인산화 여부를 조사하였다. PKR-△12의 경우 단독으로는 인산화되지 않으며 야생주 PKR의 존재시 야생주 PKR에 의해서 PKR-△12 단백질이 인산화될 수 있음을 확인하였다. 또한 PKR-△12는 야생주 PKR과 동시에 존재시 야생주 PKR의 자체 인산화 효소활성을 저해하는 효과가 없는 것을 확인하였다. 이러한 PKR 단백질들은 VeroE6 세포에서의 cap-의존적 혹은 cap-비의존적 단백질 번역과정에 있어서 상보적인 역할을 수행함을 표지자 분석법으로 확인하였다. 즉, 야생주 PKR 단백질은 cap-비의존적 번역을 활성화 시키는 반면, PKR-△12는 cap-의존적 번역과정을 활성화시키는 것을 관찰하였다.
이러한 결과는 한타바이러스를 포함하는 여러 가지 바이러스의 감염에 대해 항바이러스 효과를 유발하는 인터페론에 의한 조절기 작에서 PKR의 발현이나 활성의 조절이 중요한 역할을 한다는 것을 시사한다.

Hantaviruses are enveloped, negative-strand RNA viruses, causing a hemorrhagic fever with renal syndrome and a virus-associated pulmonary syndrome which can be lethal to human. To understand the molecular basis of these pathogenic viruses, my research beared on the anti-hantaviral effect of interferons. In particular, research was focused on the dsRNA-dependent protein kinase (PKR), one of the key IFN-inducible proteins and the mediators of antiviral effect. IFN-α treatment of VeroE6 cells caused induction of antiviral state against Hantaan virus (HTN), the prototype of Hantaviruses. Viral titer was reduced 10~100-fold compared with mock-treated cells at 1~3 days post infection. However, IFN-induced anti-HTN effect was transient and relieved at later phase. To understand the antiviral actions of the interferons, monkey PKR cDNA was cloned from VeroE6 cells by RT-PCR. The PKR cDNA comprised 135 bp of the 5'-UTR, 1,650 bp of the protein coding sequence, and 878 bp of the 3'-UTR. The monkey PKR showed 83% and 60% amino acid identity to those of human and mouse (or RAT) homologs, respectively. In addition to the wild type PKR gene, a smaller form of PKR cDNA was found in the VeroE6 cells. Sequence analysis indicated that the mutant PKR has in-frame deletion of the 12th exon. Further analysis indicated that the mutant PKR is produced by an alternative splicing rather than by a genomic alteration. RT-PCR and immunoblot analyses showed that smaller PKR (named PKR-△12) was not expressed in human cells such as HeLa and Jurkat, nor in another monkey kidney CV-1 cell. IFN treatment and/or HTN infection induced PKR cleavage in VeroE6 cells. This cleavage occurred between 247^(th) and 248^(th) amino acid residues, causing the appearance of PKR kinase domain fragment (PKR-KD). Immunohistochemical analysis showed that both PKR and PKR-△12 have same intracellular localization, predominantly in the cytoplasm. Some of the cells transfected with PKR-△12 showed cytotoxicity.

목차

Table of Contents = ⅰ
List of Tables = ⅲ
List of Figures = ⅲ 
Abstract = ⅴ
Introduction = 1
 1. Hantavirus = 1
 2. Interferon (IFN) = 3
 3. DsRNA-dependent protein kinase R (PKR) = 5
 4. The Scope of the current study = 13
Materials and Methods = 16
 1. Cells and viruses = 16
 2. Cloning of the monkey PKR cDNA = 16
  2.1 Interferon alpha treatment and mRNA purification = 16
  2.2 Rapid amplification of cDNA ends (RACE) of monkey PKR = 17
  2.3 Monkey PKR 3’-end sequence analysis = 21
  2.4 Construction of PKR expression vector = 21
 3. Protein expression = 23
  3.1 Protein expression with the vaccinia/T7 system = 23
  3.2 Protein expression with coupled in vitro transcription/translation = 23
 4. Immunoprecipitation of PKRs = 24
 5. Mapping of PKR cleavage site = 25
 6. Genomic southern blot analysis = 25
 7. Western blotting = 27
 8. Immuno-Fluorescent assay = 27
 9. In vitro PKR activation assay = 28
 10. Reporter assay = 29
Results and Discussion = 30
 1. IFN-α has inhibitory effect on Hantaan virus in early infection phase = 30
 2. IFN-α induces PKR cleavage at early times = 34
 3. HTN infection induces PKR cleavage = 36
 4. VeroE6 cells express mutant PKR (PKR-?12) = 38
 5. PKR-?12 protein is expressed in VeroE6 cells in low amount = 47
 6. Mapping of PKR cleavage site = 51
 7. Monkey PKR-?12 lacks auto-phosphorylation kinase activity = 57
References = 63
Abstract in Korean = 74