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Cholesterol-lowering Peptide from Soybean Protein Hydrolysates Prepared with Proteases from Bacillus amyloliquefaciens FSE-68

Cholesterol-lowering Peptide from Soybean Protein Hydrolysates Prepared with Proteases from Bacillus amyloliquefaciens FSE-68 (1회 대출)

자료유형
학위논문
개인저자
조성준
서명 / 저자사항
Cholesterol-lowering Peptide from Soybean Protein Hydrolysates Prepared with Proteases from Bacillus amyloliquefaciens FSE-68 / Seong-Jun Cho.
발행사항
서울 :   고려대학교 ,   2002.  
형태사항
133 p. : 삽도 ; 26 cm.
학위논문주기
학위논문(박사) -- 고려대학교 대학원 생명공학과 2002
학과코드
0510   6YD48   56  
서지주기
참고문헌 : p. 116-130
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전자정보

No. 원문명 서비스
1
Cholesterol-lowering Peptide from Soybean Protein Hydrolysates Prepared with Proteases from Bacillus amyloliquefaciens FSE-68
PDF 초록 목차
No. 소장처 청구기호 등록번호 도서상태 반납예정일 예약 서비스
No. 1 소장처 과학도서관/원문DB구축실/ 청구기호 0510 6YD48 56 등록번호 123020999 도서상태 대출불가(자료실) 반납예정일 예약 서비스 M
No. 2 소장처 과학도서관/학위논문서고/ 청구기호 0510 6YD48 56 등록번호 123020998 도서상태 대출가능 반납예정일 예약 서비스 B M
No. 3 소장처 세종학술정보원/학위논문실/ 청구기호 0510 6YD48 56 등록번호 153042865 도서상태 대출가능 반납예정일 예약 서비스
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No. 2 소장처 과학도서관/학위논문서고/ 청구기호 0510 6YD48 56 등록번호 123020998 도서상태 대출가능 반납예정일 예약 서비스 B M
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No. 1 소장처 세종학술정보원/학위논문실/ 청구기호 0510 6YD48 56 등록번호 153042865 도서상태 대출가능 반납예정일 예약 서비스

컨텐츠정보

초록

Soybean protein and its hydrolysate have been reported to have cholesterol lowering property; however, exact mechanisms and responsible components are still unknown.
In this study, we have isolated several strains from Meju, a Korean soybean fermentation starter, and one promising strain, Bacillus amyloliquefaciens FSE-68 was identified on the basis of biophysical tests and 16S rRNA gene sequence. A neutral metallo-protease (NPR68) and an alkaline serine-protease (APR68) were purified by two step purification, first by ammonium sulfate precipitation and then cation exchange chromatography. The proteases were identified based on their activities at different pH and the selective protease inhibitors. The molecular weights of NPR68 and APR68 measured with ESI-MS were 32,743 (±0.8) Da and 27,443 (±0.5) Da, respectively. Against oxidized insulin chains, the NPR68 has a cleavage preference at the site where leucine is located as a P1' residue followed by phenylalanine, and the APR68 has broad specificity and favors leucine at P1 site.
In order to obtain whole protein sequence, tryptic peptides of NPR68 and APR68 were analyzed with high performance liquid chromatography/electrospray ionization mass spectrometry and tandem mass spectra (LC/ESI-MS/MS) analysis. PCR primers for DNA sequencing were designed based on peptide sequences deduced from LC/ESI-MS/MS analysis. The structural gene for alkaline protease (apr68) and neutral protease (npr68) were sequenced with PCR and inverted PCR techniques. The apr68 includes an open reading frame of 1,146 bp that encoded a pre sequence, a pro sequence, and a mature protease (275 amino acids, 27,447 Da). The npr68 includes 1,563 bp and its deduced amino acid sequence for the mature protease (300 amino acids, 32,744 Da) was preceded by a pre sequence and a pro sequence. Based on homology of the DNA sequence, apr68 belongs to Subtilisin family and npr68 belongs to Bacillolysin family.
To identify the cholesterol lowering mechanism of soybean protein hydrolysates (SPHs) and the responsible components, inhibition of bile acid or cholesterol absorption, inhibition of cholesterol synthesis, and stimulation of low-density lipoprotein receptor (LDL-R) transcription were tested.
Six types of SPHs were prepared with the proteases from B. amyloliquefaciens FSE-68. When human hepatic cells were incubated with SPHs, LDL-R transcription was strongly stimulated. Among the six types of soy protein hydrolysate, F1-15, hydrolyzed with the neutral protease to DH 15%, showed the highest LDL-R transcription. F1-15 was fractionated with GPC and each fraction was tested. The peptide fractions molecular weight between 200 Da and 3,000 Da only showed LDL-R stimulating activity. The active fraction was further separated by using reverse-phase chromatography, and several peptides were identified by LC-MS and MS/MS analysis. Peptides were synthesized based on identified sequences and their effect on LDL-R transcription was test in vitro. Among the synthesis peptides FVVNATSN showed the strongest activity and LDL-R transcription in hepatic cells was increased by 150% (vs. control)대두 단백질과 그 가수분해물의 혈중 콜레스테롤 저하효과에 대해서는 많은 연구가 있어왔으나, 그 기작과 작용에 관여하는 물질에 관한 연구는 부족한 현실이다.
본 연구에서는 메주로부터 여러 종류의 미생물을 분리한 후, 그 중 대두 단백질 가수분해물 생성에 적합한 균주를 분리 및 동정하였으며, Bacillus amyloliquefaciens FSE-68이라고 명명하였다. 이 균주로부터 두 종류의 protease 들을 ammonium sulfate 침전법과 양이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 분리하였으며, 조건 최적화를 통하여 비교적 간단한 정제과정을 통해 고순도의 분리가 가능하게 하였다.
위의 protease 들은 최적 작용 pH와 선택적인 protease inhibitor 등을 이용하여 각각 중성 metallo-protease (NPR68)과 알칼리성 serine protease (APR68)라는 것을 확인하였다. 전자분사이온화-질량분석기(ESI-MS)를 이용해 측정한 NPR68 과 APR68의 분자량은 각각 32,743 (±0.8) Da 과 27,443 (±0.5) Da 이였다. oxidized insulin chain-A와 B를 이용하여 각각 proteases 의 specificity를 측정하였다. NPR68은 P1’ 쪽에 leucine이 존재하는 펩타이드 결합을 가장 먼저 분해하였으며, 다음으로 phenylalanine 이 존재하는 결합을 분해하였다. APR68은 비교적 넓은 specificity를 가지고 있었으며, 특히 P1 쪽에 leucine 이 있는 결합을 비교적 잘 분해하였다.
분리한 protease 들의 전체 아미노산 서열을 밝혀내기 위해, 먼저 실활시킨 각각의 protease를 트립신을 이용해 가수분해하였으며, 이때 생성된 peptide 들을 LC/ESI-MS와 MS/MS를 이용하여 분석하였다. MS 분석결과를 바탕으로 전체 DNA 염기 서열분석을 위한 PCR primer들을 제작하였으며, 이 primer 들을 이용해 PCR와 inverted PCR을 수행하고, sequencing하여 protease들의 1차 구조를 밝혔다.
알칼리성 protease의 유전자(apr68)는 총 1,146 bp 로 구성되어 있고, pre-pro-mature의 구조를 가지고 있다. mature protease는 총 275개의 아미노산으로 구성되어 있고 유추된 분자량은 27,447 Da 이었다. 중성 protease의 유전자(npr68)는 총 1,563 bp 로 구성되어 있으며, mature protease 는 총 300개의 아미노산으로 구성되어있고 그 분자량은 32,744 Da 이었다. 이들 유전자의 유사성 분석을 통해 apr68은 Subtilisin 계열, npr68은 Bacillolysin 계열임을 알 수 있었다.
대두 단백질 가수분해물의 콜레스테롤 저하기작과 작용물질을 밝혀내기 위해, 대두 단백질 가수분해물의 담즙산과 콜레스테롤 흡수 저해효과, 콜레스테롤 합성 저해 효과, 저밀도 콜레스테롤 수용체 (LDL-R)발현의 stimulation 효과를 측정하였다.
B. amyloliquefaciens가 생성하는 protease들을 이용하여 6종의 대두 단백질 가수분해물을 제조하였으며, 간세포와 reporter gene을 이용한 in vitro 시험에서 이들 가수분해물에 의한 LDL-R의 발현증가를 확인하였다. 또한 대두 단백질 가수분해물이 다른 기작에는 영향을 주지 않는 것으로 보아 이들의 콜레스테롤 저하효과는 LDL-R의 발현과 밀접한 관계가 있음을 알 수 있었다.
여섯종의 대두 단백질 가수분해물 중에서 중성 protease를 이용해 DH 15%까지 가수분해한 F1-15이 가장 높은 LDL-R을 발현증가를 보였다. 이 F1-15를 GPC를 이용해 분자량별로 분획하여 실험한 결과, 분자량 200 Da에서 3,000 Da 사이의 펩타이드만이 효과가 있음을 확인할 수 있었다. 위 분획을 역상 크로마토그래피를 이용하여 더 분획 하였으며, 가장 활성이 높은 분획에 존재하는 펩타이드의 서열을 ESI-MS와 MS/MS 분석을 이용하여 밝혀내었으며, 이 결과를 바탕으로 펩타이드를 합성하여 in vitro에서 그 활성을 확인하였다. 최종적으로 대두 단백질 가수분해물의 펩타이드 중 FVVNATSN의 서열을 가지는 펩타이드가 가장 높은 활성을 나타내었으며, 간세포에 100 uM의 농도로 처리했을 때 대조구보다 활성이 150% 증가하였다

목차

Abstract = 3
Table of Contents = 5
Chapter Ⅰ. Introduction = 8
 Ⅰ-1. Overview of lipid metabolism = 8
 Ⅰ-2. Relation for cardiovascular disease and serum cholesterol = 9
 Ⅰ-3. Targets for cholesterol-lowering therapy = 12
  Ⅰ-3-1. Inhibition fo HMG-CoA reductase = 12
  Ⅰ-3-2. Blockade of dietary cholesterol absorption = 14
  Ⅰ-3-3. Activation of 7α-hydroxlyase = 15
  Ⅰ-3-4. Blockade of bile acid reabsorption = 17
  Ⅰ-3-5. Stimulation of hepatic LDL receptor = 18
 Ⅰ-4. Relationship of soybean and cardiovascular disease = 19
  Ⅰ-4-1. Potential cholesterol lowering mechanism of soybean = 21
  Ⅰ-4-2. Soybean protein or peptides as cholesterol-lowering components = 22
 Ⅰ-5. Beneficial effect of fermented soybean and Meju = 23
 Ⅰ-6. Objectives = 24
Chapter Ⅱ. Purification and characterization of proteases from Bacillus amyloliquefaciens isolated from traditional soybean fermentation starter = 25
 Ⅱ-1. Introduction = 25
 Ⅱ-2. Materials and methods = 26
  Ⅱ-2-1. Bacterial strains = 26
  Ⅱ-2-2. Chromosomal DNA isolation = 26
  Ⅱ-2-3. Phenotypic characterization = 27
  Ⅱ-2-4. Sequencing of the 16S rRNA gene = 27
  Ⅱ-2-5. Production of proteaes = 28
  Ⅱ-2-6. Protein determination = 29
  Ⅱ-2-7. Protease activity assay = 29
  Ⅱ-2-8. Purification of proteases = 30
  Ⅱ-2-9. N-terminal sequencing = 30
  Ⅱ-2-10. Hydrolysis of oxidized insulin chains = 31
  Ⅱ-2-11. LC/MS and MS/MS analysis = 31
  Ⅱ-2-12. Characterization of proteases = 32
 Ⅲ-3. Results = 33
  Ⅱ-3-1. Strain properties and identification = 33
  Ⅱ-3-2. Purification of proteases = 36
  Ⅱ-3-3. N-terminal amino acid sequence analysis = 41
  Ⅱ-3-4. Substrate specificity = 41
  Ⅱ-3-5. Effect of pH on protease activity and stability = 48
  Ⅱ-3-6. Thermostability of protease = 48
 Ⅱ-4. Discussion = 51
Chapter Ⅲ. Cloning and Primary structure of Proteases from Bacillus amyloliquefaciens FSE-68 by Mass Spectrometry and DNA Sequencing = 54
 Ⅲ-1. Introduction = 54
 Ⅲ-2. Materials and methods = 55
  Ⅲ-2-1. Bacterial strains and plasmids = 55
  Ⅲ-2-2. Purification of proteases = 55
  Ⅲ-2-3. Digestion with trypsin and S. aureus V8 protease = 56
  Ⅲ-2-4. Analysis of peptides by LC/MS and MS/MS = 56
  Ⅲ-2-5. PCR amplification and DNA sequencing = 57
  Ⅲ-2-6. Inverted PCR = 58
  Ⅲ-2-7. Cloning and expression of proteases in L. lactis = 59
  Ⅲ-2-8. Protease activity assay = 59
 Ⅲ-3. Results = 60
  Ⅲ-3-1. Preliminary primary structure analysis = 60
  Ⅲ-3-2. DNA sequencing of npr68 = 60
  Ⅲ-3-3. DNA sequencing of apr68 = 62
  Ⅲ-3-4. Cloning and expression of the B. amyloliquefaciens FSE-68 proteases in L. lactis and E. coli = 63
  Ⅲ-3-5. DNA. sequence of proteases = 66
  Ⅲ-3-6. Confirmation of the primary sequences = 71
 Ⅲ-4. Discussion = 77
Chapter Ⅳ. Identification of low-density lipoprotien cholesterol receptor stimulating peptide from soybean protein hydrolysate = 82
 Ⅳ-1. Introduction = 82
 Ⅳ-2. Materials and methods = 83
  Ⅳ-2-1. Preparation of soybean protein hydrolysates = 83
  Ⅳ-2-2. Ethanol extract of isolated soybean protein = 85
  Ⅳ-2-3. Bile acid binding capacities of soybean protein hydrolysates = 85
  Ⅳ-2-4. Micellar solubility of cholesterol = 85
  Ⅳ-2-5. Cell culture = 86
  Ⅳ-2-6. Measurement of LDH leakage = 88
  Ⅳ-2-7. Lipid synthesis inhibition = 88
  Ⅳ-2-8. Protein quantification = 89
  Ⅳ-2-9. DNA transfection and reporter gene analysis = 89
  Ⅳ-2-10. Purification of cholesterol lowering peptides = 90
  Ⅳ-2-11. Analysis of peptides with LC/MS and MS/MS = 92
  Ⅳ-2-12. Soybean protein sequences and database searches = 92
  Ⅳ-2-13. Statistical analysis = 93
  Ⅳ-2-14. Chemical synthesis of peptides = 93
 Ⅳ-3. Results = 96
  Ⅳ-3-1. Soybean peptides by using B. amyloliquefaciens FSE-68 = 96
  Ⅳ-3-2. Bile acid binding capacities of soybean peptides = 96
  Ⅳ-3-3. Micellar solubility of cholesterol = 96
  Ⅳ-3-4. LDH leakage = 101
  Ⅳ-3-5. Inhibition of lipid synthesis = 101
  Ⅳ-3-6. Stimulation of LDL-R transcription by soybean peptides = 106
  Ⅳ-3-7. Purification of LDL-R transcription stimulating soybean peptides = 109
  Ⅳ-3-8. Identification of peptides with LC/MS and MS/MS = 109
  Ⅳ-3-9. Effect of synthetic peptides on LDl-R transcription = 115
 Ⅳ-4. Discussion = 118
Chapter Ⅴ. References = 123
Abstract in Korean = 138