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S100A10 단백질에 의한 B형간염바이러스 중합효소의 전골수성백혈병핵체 결합에 관한 연구

S100A10 단백질에 의한 B형간염바이러스 중합효소의 전골수성백혈병핵체 결합에 관한 연구

자료유형
학위논문
개인저자
최주현
서명 / 저자사항
S100A10 단백질에 의한 B형간염바이러스 중합효소의 전골수성백혈병핵체 결합에 관한 연구 = Association of Hepatitis B Virus Polymerase with Promyelocytic Leukemia Nuclear Bodies Mediated by the S100 Family Protein p11 / Juhyun Choi.
발행사항
서울 :   고려대학교 ,   2002.  
형태사항
107 p. : 삽도 ; 26 cm.
학위논문주기
학위논문(박사) -- 고려대학교 대학원 생명공학과 2002
학과코드
0510   6YD48   55  
서지주기
참고문헌 : p. 78-104
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전자정보

No. 원문명 서비스
1
S100A10 단백질에 의한 B형간염바이러스 중합효소의 전골수성백혈병핵체 결합에 관한 연구
PDF 초록 목차
No. 소장처 청구기호 등록번호 도서상태 반납예정일 예약 서비스
No. 1 소장처 과학도서관/학위논문서고/ 청구기호 0510 6YD48 55 등록번호 123020995 도서상태 대출가능 반납예정일 예약 서비스 B M
No. 2 소장처 세종학술정보원/학위논문실/ 청구기호 0510 6YD48 55 등록번호 153042872 도서상태 대출가능 반납예정일 예약 서비스
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컨텐츠정보

초록

간염 B 바이러스의 polymerase (HBV pol)는 이 바이러스의 초기 생명 순환 단계에 매우 중요한 역할을 한다. 인간(HBV pol)과 오리(DHBV pol)의 polymerase를 단백질 효모 발현 방법을 통하여 발현 하였다. 발현된 DHBV pol은 DNA 의존 DNA 합성, RNA 의존 DNA 합성, 그리고 RNassH 활성을 보였고, 발현된 HBV pol은 DNA 의존 DNA 합성 활성만을 보였다. 이 바이러스 polymerase 활성 측정방법은 최초로 효모를 이용한 단백질 발현 방법을 이용 하였으며 손쉽고 정확하게 각 바이러스 단백질의 여러 가지 활성을 측정 가능 하게 하였다.
HBV pol은 간연 B 바이러스가 감염된 세포의 여러 단백질과 결합하여 여러 가지 기능을 수행함이 보고 되고 있다. 본 연구는 이런 사실을 확인 하고 새로운 단백질 발굴을 위하여 효모 2 하이브리드 방법을 이용하여 HBV pol과 결합할 수 있는 인간 뇌 발현 단백질 라이브러리를 검색하였으며 인간 세포네에서 amnexinll 단백질과 결합하는 11의 kDa의 칼슘결합 단백질인 Slooa10(p11)을 검색하여 냈다. 또한 이 p11은 HBV pol의 DNA 의존 DNA 합성 활성을 in vitro와 인간 세포주인 293T 세포에서 60%이상 감소시킴을 확인하였다. 인간 간암 세포주인 HEPG2세포에 HBV pol과 p11을 동시에 트렌스펙션 후 공초점형광현미경을 이용한 형광면역분석을 수행하여본 결과 대부분의 두 단백질은 세포질에 머무르는 것으로 확인되었고 소량의 두 단백질이 세포핵에 작은 반점을 이루는 것을 관찰하였다. 이 작은 반점은 전골수성백핼병핵체 (PML NBs)임을 전골수성백혈병단백질 단일항체로 세포네 핵에 존재함을 확인 하였다. p11은 세포네 칼슘의 농도에 따라 HBV pol을 세포핵의 PML NBs로 이동시킴을 확인하였다. 이러한 결과로 미루어 볼 때 p11은 HBV pol을 통한 바이러스 생명 순환에 능동적 역할을 수행하며, 세포네 칼슘의 농도가 이런 p11의 기능을 조절하는 것으로 사료 된다.The human and duck Hepatitis B VIrus polymerase (HBV Pol and DHBV Pol) were expressed using a yeast system, Pichia methanolica. HBV (1∼680 ammo acids) and DHBV (DHBV,1-780 ammo acids) Pol were expressed and showed DNA dependent DNA polymerase (DDDP). The DHBV Pol had RNA dependent DNA polymerase (RDDP) and RNase H \activities. We present a new simplified way of obtaining active viral Pol using the yeast expression system. The viral Pols proved to be stable and were not aggregated in the yeast system.
HBV Pol interacts with cellular chaperone proteins and thereby performs multiple functions necessary for viral replication. Yeast two-hybrid analysis was applied to identify additional cellular factor required for Pol function. HBV Pol interacted with SlOOAlO (P11), a Ca(^2+) -modulated protein previously described to bind to annexin II. The interaction between Pol and 
pll was confirmed by co-immunoprecipitation of the two proteins synthesized either in vitro or in transfected cells and by inhibition of the DNA polymerase activity of Pol by pll.
Immunofluorescence analysis of transfected human cell lines revealed that, although most Pol and pll was restricted to the cytoplasm, a small proportion of each protein colocalized as nuclear speckles; Pol was not detected in the nucleus in the absence of pll. The Pol-pll nuclear speckles coincided with nuclear bodies containing the promyelocytic leukemia protein PML. Furthermore, the association of Pol-pll with PML was increased by exposure of cells to EGTA and inhibited by valinomycin. These results suggest a role for pll in modulation of HBV Pol function and implicate PML nuclear bodies and intracellular Ca(^2+) in viral replication. Our present data therefore suggest that pll may function to transport HBV Pol to PML NBs and thereby to inhibit viral replication. An apparently contradictory role for PML NBs is to serve as nuclear sites for the transcription and replication of the genome of certain DNA vauses. According to this hypothesis, association of HBV Pol and pll with PML NBs may help the viral genome transport to the nucleus for initiation of transcription.

목차

CONTENTS = ⅳ
Abstract = ⅰ
Contents = ⅳ
List of Figures = ⅷ
Abbreviatiol1s = ⅹⅰ
1. Introduction  = 1
 1.1. Hepatitis B virus = 1
 1.2. The family of hepadl1avirida = 2
 1.3. Replicatiol1 of the Hepatitis B Virus gel1 = 4
  1.3.1. Virus ell tr = 4
  1.3.2. Formatiol1 of covalel1tly closed circular (CCC) DNA = 5
  1.3.3. Assembly of core particles al1d primil1g of reverse tral1scriptiol1 = 9
  1.3.4. Viral DNA sYl1thesis = 10
  1.3.5. Assembly of virions versus amplification of CCC DNA = 12
  1.3.6. Budding and secretion of mature virions and non-infectious particles = 15
 1.4. Cellular chaperone of the HBV Pol = 16
 1.5. S100A10 (p11) = 18
 1.6. PML nuclear body and HBV = 22
 1.7. Purpose of the study = 23
2. Materials and Methods = 25
 2.1. Construction of plasmids = 25
 2.2. Yeast transformation and the selection of transformants = 26
 2.3. Small scale expression tests = 27
 2.4. Scale-up and optimization of the protein expressio = 28
 2.5. Cell lysis and column purification = 28
 2.6. Western blot analysis = 30
 2.7. Polymerase activity assay = 30
 2.8. Yeast and bacterial strains = 33
 2.9. Cell lines and antibodies = 34
 2.10. Yeast two-hybrid analysis = 34
 2.11. GST pull-down assay and Co-immunoprecipitation of Pol and pll in vitro = 36
 2.12. Expression of Pol and pll in mammalian cells = 37
 2.13. Assay of HBV Pol activity = 38
 2.14. Immunofluorescence analysis = 38
3. Results = 40
 3.1. Cloning and expression of the viral Pols = 40
 3.2. Purification of the viral Pols = 43
 3.3. DNA polymerase activity assay using DNA template = 44
 3.4. DNA polymerase activity assay using RNA template = 50
 3.5. RNase H activity assay = 52
 3.6. Interaction of Pol with pH in the yeast two-hybrid system = 52
 3.7. Inhibition of Pol activity by association with pH in vitro = 57
 3.8. Colocalization of HBV Pol and pH in mammalian cells = 63
 3.9. Colocalization of Pol and pH with PML NBs = 65
 3.10. Inhibitory effect of Ca2+ on the association of Pol with PML NBs = 69
 4. Discussion = 71
 5. References = 78
국문요약 = 105