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오이 모자이크 바이러스의 병징 결정인자의 분자적 규명

오이 모자이크 바이러스의 병징 결정인자의 분자적 규명

자료유형
학위논문
개인저자
최승국
서명 / 저자사항
오이 모자이크 바이러스의 병징 결정인자의 분자적 규명 = MOLECULAR DISSECTION OF SYMPTOM DETERMINANTS OF Cucumber mosaic virus / SEUNG KOOK CHOI.
발행사항
서울 :   고려대학교,   2002.  
형태사항
211 p. : 삽도 ; 26 cm.
학위논문주기
학위논문(박사)-- 고려대학교 대학원: 생명공학과, 2002
학과코드
0510   6YD48   53  
서지주기
참고문헌 : p. 188-211
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전자정보

No. 원문명 서비스
1
오이 모자이크 바이러스의 병징 결정인자의 분자적 규명
PDF 초록 목차
No. 소장처 청구기호 등록번호 도서상태 반납예정일 예약 서비스
No. 1 소장처 과학도서관/학위논문서고/ 청구기호 0510 6YD48 53 등록번호 123020989 도서상태 대출가능 반납예정일 예약 서비스 B M
No. 2 소장처 세종학술정보원/학위논문실/ 청구기호 0510 6YD48 53 등록번호 153042864 도서상태 대출가능 반납예정일 예약 서비스
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No. 1 소장처 과학도서관/학위논문서고/ 청구기호 0510 6YD48 53 등록번호 123020989 도서상태 대출가능 반납예정일 예약 서비스 B M
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No. 1 소장처 세종학술정보원/학위논문실/ 청구기호 0510 6YD48 53 등록번호 153042864 도서상태 대출가능 반납예정일 예약 서비스

컨텐츠정보

초록

본 연구에서는 오이 모자이크 바이러스(Cucumber mosaic virus: CMV)의 병리학적 기능과 병징 결정인자의 분자적 규명을 실시하였다. Cucumovirus 속의 CMV, Tomato aspermy virus (TAV) alc Peanut stunt virus (PSV) tp 세 종류의 바이러스를 분자적으로 동정하기 위해, Cucumovirus 속 프라이머 세트 (CPTALL-3와 CPTALL-5)를 제작하였다. 역전사 효소중합 연쇄 반응법을 사용한 결과, 본 프라이머세트는 상기 3종의 cucumovirus 들에 대한 DNA 단편들이 합성되었으며, 공통 기주식물체로부터 유래된 복합감염(CMV와 TAV, CMV와 PSV, TVA와 PSV 및 CMV, TAV와 PSV)에서도 DNA 절편들이 합성되었다. 이런 결과들은 제작된 프라이머들이 cucumovirus에 대해 특이적으로 반응한 결과로 사료된다. 또한, 합성된 DNA 단편들은 restriction fragment length polymorphism 분석법과 병행시 각각의 cucumovirus 종을 구분할 수 있었다. 국내에서 재배되는 작물들로부터 CMV의 유전적 변이와 진화양상을 조사하기 위하여, CMV 외피 단백질(coat protein) 유전자에 대한 염기서열 비교 및 계통도 분석 결과, 31개 분리주들은 모두 CMV subgroup Ⅰ에 속하였다. 또한, subgroup IB에 속하는 1개의 분리주 (As계통)를 제외하고는 모든 CMV 분리주들은 CMV subgroup IA에 속하였다.
CMV의 병리학적 특성을 규명하기 위하여, 호박에서 전신 이동이 결여된 CMV 분리주(M 계통)와 또 다른 바이러스 속인 오이 황화모자이크 바이러스(Zucchini yellow mosaic virus: ZYMV) 두 분리주 (A계통과 AG 계통)를 이용하였다. CMV-M과 ZYMV-A의 동시 접종시 CMV-M 계통은 호박의 상엽으로의 전신 이동이 가능하며 더욱이 상승효과 (synergism)를 나타내었다. 또한 CMV-M 계통은 약동 ZYMV 변이주 (ZYMV-AG)와의 동시 접종시에도 호박의 상엽으로 CMV-M 계통의 전신 감염이 이루어졌으며 상승효과도 발생시켰다. 그러나 호박에서의 CMV-M과 ZYMV-AG의 상승효과는 CMV-M과 ZYMV-A의 것에 비해 약하였다.
분자적 수준에서 가주 식물체에서의 CMV 병징 결정인자를 밝하기 위해서,  CMV 3 계통과 호박을 기주로 연구하였다. 호박에서 CMV 의 고추 분리주 (Pf계통)은 황화반점 (chlorotic spot)을 상엽에서 접종 후 9일에 발생을 시키는 반면에 Fny 계통은 모자이크 및 위축현상을 접종 후 4일에 유도한다. 호박에서 병징의 발현시기와 세기에 관여하는 서열을 결정하기 위하여, Pf 계통과 Fny 계통간의 김염성이 있는 클론으로부터 다양한 유전재조합 바이러스 (pseudorecombinant)와 교잡바이러스들(chimeras)을 제작하여 호박에 접종하였다. 그 결과 Pf 계통의 바이러스 복제효소(replicase)에 존재하는 267번째 아미노산과 이동단백질(movement protein)의 168번째 아미노산이 병징 발현 및 시기에 관여하는 결정인자임이 규명되었다. 분자 생물학적 연구에 의해 두 아미노산들의 상호 작용이 호박에서의 병징의 세기 및 발현 시기에 중요함을 알 수 있었다. 병징의 정도 및 발현 시기는 바이러스의 복제에 의한 것보다는 바이러스 이동 속도에 기인하였다. 또한, 호박에서 전신 감염을 할 수 없는 CMV 백합 계통 (LK-CMV)에 대한 병원성 및 병징 결정인자의 분자적 지도를 작성하였다. LK 계통의 게놈의 3'비번역 부위에 다른 계통들에서 발견이 안 되는 보존적인 20개의 염기들이 존재하였으나 호박에서의 병징 발현에는 영향을 주지를 못했다. RNA3의 염기서열의 분석 결과, LK계통의 게놈은 RNA3 subpopulation으로 구성되어 있었다. 각 RNA3를 Fny 계통의 RNA1, 2와 호박에서의 접종시 동일한 병징을 유도했으나 그 병징은 심한 모자이크 병징에서 황화반점으로 변하였다. 이런 병징 결정 인자를 규명하기 위하여 RNA3의 교잡바이러스를 제작, 사용한 결과 LK 계통의 이동 단백질에 위치하는 234, 239, 250번째의 3개 아미노산들이 황화반점을 유도하는 병징 결정인자로 규명되었다. 이런 호박에서의 병징 변화는 상엽에서의 바이러스 RNA 축적 속도와 깊은 연관이 있었다. 또한 유전자 재조합 CMV를 이용하여 LK 계통의 병원성 결정인자를 분석한 결과 RNA2가 호박의 전신 감염에 중요한 역할을 하는 것으로 판명되었다.
이러한 결과들은 CMV 게놈상의 아미노산을 지정하는 서열들이 바이러스 이동 속도에 영향을 주며, 바이러스의 복제보다는 기주 식물에서의 바이러스 이동 속도가 호박에서의 병징의 유도 및 병원성에 중요한 역할을 한다는 것을 의미하고 있다.The pathological and molecular functions for symptom determinants of Cucumber mosaic virus (CMV) were studied to understand plant-virus interactions. To detect three members of cucumoviruses such as Tomato aspermy virus (T A V) and Peanut stunt virvs (PSV), a Cucumovirus-genusspecific primer set (CPTALL-3 and CPTALL-5) was designed to amplify a DNA fragment of approximately ranging 938 to 966 base pairs. The reverse transcription and polymerase chain reaction (RT-PCR) analysis was shown that the target sizes of DNA fragments in all the tested cucumoviruses were amplified. The primers successfully amp'lified cDNAs fragments from various mixed infections of double or triple virus combinations derived from common hosts for the cucumoviruses, indicated the primers were specific to all the three members of cucumoviruses. Cucumoviruses could be differentiated into species by RT-PCR with restriction fragment length polymorphism analysis.
The phylogenetic tree analysis based on multiple alignments of coat protein (CP) sequences showed that 31 tested CMV isolates investigated belonged to CMV subgroup I. They were subdivided into subgroup lA, except for As strain of CMV into subgroup lB.
To assess the pathology of CMV, M strain of CMV (M-CMV) that was deficient-systemic movement in squash and two strains of a Potyvirus, Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV) were used as model system in this study. Co-infection of M-CMV with A strain of ZYMV (ZYMV-A) in zucchini squash showed that M-CMV could infect systemically on upper leaves, and produced synergistic effects in pathology. Double infection of M-CMV with an attenuated strain, AG strain of ZYMV (ZYMV-AG) induced very mild symptom in squash showed that M-CMV was also able to move systemically, and squash plants were shown the synergistic pathology. However, synergism of M-CMV plus ZYMV-AG in squash was weaker than that of M-CMV plus ZYMV-A.
To elucidate the symptom determinants of CMV- on host plan\s, interactions between three CMV strains and zucchni sqaush were investigated. In squash, a pepper strain of CMV (designated Pf-CMV) induced a mild chlorotic symptom on systemic leaves at 9 days post-inoculation (dpi).
Meanwhile, Fny strain of CMV (Fny-CMV) in squash produced rapid expression of severe mosaic and stunt symptom at 4 dpi. To identify what the sequences affected the induction time and severity of symptoms in zucchni sqaush, a series of pseudorecombinants and chimeras between Pf-CMV and Fny-CMV were constructed and inoculated onto squash paints. The results showed that the symptom determinats of Pf-CMV in zucchini squash were the amino acid 267 in viral replicase encoded in RNA2 and the amino acid 168 in movement protein (MP) encod~d in RNA3. Molecular mapping to amino acids in replicase and MP showed that the two viral proteins were involved in symptom severity and expression time of zucchni squash. Further studies showed the amino acid 267 in viral replicase and and the amino acid 168 in MP affected the rates of virus movement. It is suggested that virus movement was resonsible for symptom induction in squash plants rather than virus replication.
Pathogenicity and symptom determinants of CMV lily isolate (LK-CMV) that were not infected systemically on squash were analyzed by molecular mapping. Sequence analysis of the genome for LK-CMV revealed that the 20 nucleotides were conserved within 3'untranslated region of RNA3, but they did not affect the pathology of LK-CMV in squash. Additionally, the genome of CMV lily isolates consisted of a RNA3 subpopulation. Each subpopulated RNAs 3 with RNAs 1 and 2 of Fny-CMV produced identical symptom in zucchni squash, but its symptom were derastically changed from severe mosaic to milcd chlorotic spot on systemic leaves. To determine the symptom determinants in squash plant, the RNA3 chimeras between LK-CMV and Fny-CMV were constructed using infectious cDNA clones of both viruses. Squash plants infected by RNA3-chimeric viruses showed that amino acids 234, 239, and 250 in MP of LK-CMV RNA3 were critical for alteration of chlorotic spot symptom. The symptom severity was correlated with kinetics of RNA accumulations. The RNA2 of LK-CMV played a role for systemic infection in squash.
These results indicate that the sequences encoding amino acids of CMV genome affect the movement rates of CMV, and virus movement function plays important roles for symotom induction and pathogenicity in squash, rather than virus replication.

목차

ACKNOWLEDGEMENTS = ⅰ
ABSTRACT = 1
TABLE OF CONTENTS = 9
LIST OF TABLES = 14
LIST OF FIGURES = 15
CHAPTER1.OVERVIEW = 19
 1.1. Taxonomy of the cucumoviruses = 20
 1.2. Biological properties = 21
 1.3. Genome structure, organization and expression = 22
  1.3.1. RNA1 = 23
   1.3.1.1. 1a protein = 24
  1.3.2. RNA2 = 26
   1.3.2.1. 2a protein = 28
   1.3.2.2. 2b protein = 28
  1.3.3. RNA3 = 29
   1.3.3.1. 3a protein (movement protein) = 30
   1.3.2.2. Coat protein = 32
  1.3.4. RNA4 = 34
  1.3.5. RNA4A = 36
  1.3.6. RNA5 and RNA6 = 36
 1.4. Virion properties and encapsidation = 37
 1.5. Objectives of the study = 40
CHAPTER 2. Molecular Diagnosis of cucumoviruses with genusspecific primers and genetic diversity of Cucumber mosaic virus in Korea = 42
 2.1. Abstract = 43
 2.2. Introd uction = 45
 2.3. Materials and methods = 48
  2.3.1. Virus source and samples = 48
  2.3.2. Viral RNA isolation and RT-PCR = 49
  2.3.3. Design of primer = 52
  2.3.4. Analysis of RT-PCR products and CP sequence = 52
 2.4. Results and discussion = 54
  2.4.1. Primer design for the genus-specific primers and optimization = 54
  2.4.2. Detection of two subgroups of CMV by the RT-PCR = 57
  2.4.3 Detection and RFLP analysis of three members of the genus = 57
  2.4.4. Genetic structure of CMV isolates in Korea = 62
CHAPTER 3. Mapping determinants of Cucumber mosaic virus for symptom induction and pathogenicity in zucchini squash = 78
 3.1 . Abstract = 79
 3.2. Introd uction = 83
 3.3. Materials and methods = 89
  3.3.1. Plant, virus source and isolation = 89
  3.3.2. Virus purification and analysis of coat protein = 90
  3.3.3. Assessment of M-CMV movement and its pathology with ZYMV = 92 
  3.3.4. Construction of full-length cDNA clones of CMV RNAs 1, 2 and 3 = 93
  3.3.5. Construction and characterization of pseudorecombinants between CMV strains = 95
  3.3.6. Generation of chimeric cDNA constructs between CMV strains = 96 
  3.3.7. Preparation, electroporation and analysis of zucchini squash protoplast = 99
  3.3.8. Extraction and analysis of CMV RNAs = 104
  3.3.9. Leaf-press blotting = 105
 3.4. Results and discussion = 106
  3.4.1. Isolation of causal virus and its host reaction = 106
  3.4.2. Immunological analysis of coat protein = 111
  3.4.3. Systemic movement of a movement-deficient Cucumber mosaic virus in zucchini squash is facilitated by a cucurbit-infecting potyvi rus = 114
  3.4.4. Identification of systemic symptom determinants conferring ability to induce chlorotic spots in zucchini squash = 124
  3.4.5. Movement protein of CMV is a symptom determinant in squash, but not sufficient:  Involvement of viral replicase = 129
  3.4.6. Viral movement is responsible for the phenotype of Pf-CMV in zucchini squash rather than virus replication = 138
  3.4.7. Identification of causal viruses infecting lily plants = 143
  3.4.8. Sequence analysis of RNAs for CMV lily strains = 146
  3.4.9. Infectivity of chimeric RNAs between LK-CMV and Fny-CMV = 157
  3.4.10. Symptom determinants of pseudorecombinant LK-CMV on zucchini squash = 167
  3.4.11. Pathogenicity determinants of LK-CMV in zucchini squash = 173
 3.5. Conclusion = 181
CHAPTER 4. REFERENCES = 188